TESTVERSION login | Lizenz erwerben

FAQ

Tipps zur Benutzung

Einführung in Colona

 

  • „Vergleich“ und „Auswahl“ sind die zwei wichtigsten Funktionen des Tools. In der Routine dürfte der (Direkt-) Vergleich von Säulen interessant sein („Ich suche eine Alternativsäule zu…“). In der Methodenentwicklung steht eher das Finden einer geeigneten Säule im Vordergrund (“Ich suche eine Säule, die…“).  Du kannst dazu direkt mit der Übersichts- Selektivitätskarte anfangen. Hier kannst du auf Wunsch gleich mit Filtern arbeiten (Eingrenzung auf Hersteller, funktionelle Gruppe, porös/Core Shell etc.). Oder du entscheidest dich für die Start-Fragen: „Ähnlichkeit mit…“, “ Unterschiedlichkeit zu…“, „Selektivität für…“. Oder aber du gehst bei Bedarf zu „unbekannte Probe?„.
  •  Es hat sich gezeigt, dass die Übersichts-Selektivitätskarte  den Charakter der Phasen (polar oder apolar?) und somit ihre Ähnlichkeit recht treffsicher wiedergibt.
    Erläuterung: Je größer der alpha-Wert EB/Fl (Selektivitätsfaktor Ethylbenzol/Fluorenon) in der Y-Achse ist, umso besser ist die hydrophobe Selektivität der entsprechenden Säule. So zeigen beispielsweise Cortecs C18 oder YMC Pro C18 RS eine gute Selektivität für die Trennung von apolaren und polaren Molekülen, von neutralen, nicht-ionischen Komponenten oder von schwachen Säuren/Basen. Je größer dagegen die alpha-Werte Tri/o-Ter (Triphenylen/o-Terphenyl) in der X-Achse sind, umso größer ist die sterische Selektivität/molekulare Erkennung dieser Säule und indirekt auch deren polare Selektivität. So trennt beispielsweise Poroshell 120 PFP oder Acclaim PA C16 planare/nicht-planare Moleküle, Isomere oder mehrkernige, unsubstituierte Aromaten sowie kleine polare Moleküle gut. Durch ihre Entfernung in der Selektivitätskarte wird darüber hinaus die Ähnlichkeit/Unterschiedlichkeit von Säulen gut sichtbar. Mithilfe von Filtern kannst du die Auswahl von Säulen eingrenzen, z. B. nur PFP-Säulen, nur Core Shell, Säulen nur von der Firma X usw.

Es wurden bewusst solche Substanzen gewählt, die es ermöglichen, die Selektivität von stationären Phasen möglichst differenziert zu erfassen: Vom hydrophoben Ethylbenzol bis zum stark basischen Benzylamin. Diese Prämisse wurde auch bei den chromatographischen Bedingungen berücksichtigt: Isokratische Läufe, Methanol/Wasser-Gemische, kein Puffer, keine erhöhte Temperatur usw.

mehr lesen

Wir verwenden Tools, die sich aus praktischer Sicht bewährt haben:

  • Selektivitätskarten

Das sind x/y-Diagramme; an der X- und Y-Achse werden alpha-Werte bestimmter Analytpaare aufgetragen, um die Ähnlichkeit/Unterschiedlichkeit der Säulen zu ermitteln. Beispiel „Übersichts-Selektivitätskarte“: Die X-Achse entspricht den alpha-Werten Ethylbenzol/Fluorenon und ist ein Maß für die hydrophobe Selektivität. In der y-Achse sind die alpha-Werte Triphenylen/o-Terphenyl aufgetragen (sterische Selektivität). Es hat sich gezeigt, dass durch diese zwei alpha-Werte die Säulen entsprechend ihrem Charakter (apolar/polar) recht gut zugeordnet werden können. Bei den weitere Selektivitätskarten  haben wir für einen Teil der Säulen feinerere Differenzierungen vorgenommen

Hier werden die Säulen entsprechend den alpha-Werten (Selektivitäten) sortiert, z. B. Fähigkeit der Säulen zur Trennung von polaren und apolaren Komponenten – das wäre die hydrophobe Selektivität. Schließlich haben wir für interessierte Anwender einige Balkendiagramme für weitere Modellsubstanzen erstellt

  • Ähnlichkeit/Unterschiedlichkeit nach eigenen Kriterien 

Hier kannst du nach bestimmten Kriterien (z. B. allgemeine Ähnlichkeit/Unterschiedlichkeit oder eben sterische Ähnlichkeit/Unterschiedlichkeit) für deine Säule die ähnlichsten/unterschiedlichsten Säulen finden. Du kannst mithilfe von Schiebern die Gewichtung bzgl. Ähnlichkeit/Unterschiedlichkeit selbst vornehmen, z. B. Ähnlichkeit nur bezogen auf hydrophobe Selektivität, auf sterische und aromatische (gleichwertig) , die polare Selektivität soll stärker gewichtet werden usw.

  • Selektivitäts-Netzdiagramme 

Sie sind gut geeignet, um die Ähnlichkeit bzw. die Unterschiedlichkeit von Säulen quasi als Icons optisch darzustellen. Folgende zwei Infos erhältst du direkt: 1. Je größer der entsprechende alpha-Wert, umso selektiver ist die Säule für diese Analyttypen. 2. Je ähnlicher/unterschiedlicher die Netzdiagramme beispielsweise von zwei Säulen sind, umso ähnlicher/unterschiedlicher sind die Selektivitätseigenschaften der betreffenden Säulen. Dies betrifft zunächst den Charakter der zwei Säulen (z. B. „hydrophob“ oder „polar“). Beim Vergleich der Trennfähigkeit dagegen geht es darum, wie ähnlich „gut“ die zwei Säulen bestimmte Analyttypen trennen können – unabhängig von der Elutionsreihenfolge. Dazu betrachten wir nur die Größe des alpha-Wertes, unabhängig davon, ob der Wert positiv oder negativ ist: Die alpha-Werte sind ggf. invertiert. Hier findest du Beispiele  zu den Erkenntnissen, die man beim Vergleich von Selektivitäts-Netzdiagrammen erhalten kann

Selektivitäts-Netzdiagramme sind geeignet, um die Ähnlichkeit/Unterschiedlichkeit von Säulen optisch darzustellen. Das Prinzip: Die alpha-Werte bei der Trennung bestimmter Analytpaare (je unterschiedlicher die gewählten Analyte sind, umso sicherer wird die Aussage) stellen die Ecken von Selektivitäts-Sechs-, -Fünf- oder -Vierecken dar. Es wird auf den höchst erreichten alpha-Wert normiert. Je größer der entsprechende alpha-Wert, umso selektiver ist die Säule für diese Analyttypen. Bemerkung: Im Fokus steht hier ausschließlich die Selektivität, nicht die Peaksymmetrie. Du kannst dir das Netzdiagramm einer bestimmten Säule oder auch die Netzdiagramme von mehreren Säulen anschauen. Hier werden fünf Beispiele mit Selektivitäts-Netzdiagrammen  kommentiert und du erhältst Erläuterungen zum Vergleich und zur Eignung von Säulen für die Trennung von aromatischen Substanzen.

Die Selektivitätsskalen findest du in der Säulentabelle (Detail-Ansicht).
Skala: Die Skala geht von 1 bis alpha-Max, dem größten alpha-Wert aller Säulen. Dass die Skala bei 1 beginnt bedeutet, dass bei allen Säulen, bei denen Elutionsumkehr vorlag, der alpha-Wert invertiert wurde.

Die Striche der Skala entsprechen den einzelnen alpha-Werten aller gemessenen Säulen. Dies gibt einen Überblick über die Verteilung und ermöglicht die Einordnung der betrachteten Säule.

Rang: Um den Rang zu ermitteln, wurden wieder die alpha-Werte bei Elutionsumkehr invertiert. Säulen mit identischem alpha-Wert (gerundet auf zwei Nachkommastellen) teilen sich den Rang. Daher kann es weniger Ränge als Säulen geben. Oder z. B. bei „sterischer Selektivität“ weniger Ränge als bei „hydrophober Selektivität“, obwohl gleich viele Säulen gemessen wurden.

Die Balkendiagramme eignen sich wahrscheinlich am besten für eine schnelle, gezielte Information: „Beste" hydrophobe, sterische (alpha-Werte Tri/o-Ter), aromatische oder polare Selektivität (alpha-Wert Perylen/Chrysen).

Zur polaren Selektivität: Der polare Charakter sollte etwas differenzierter betrachtet werden, da ja unterschiedliche polare Wechselwirkungen möglich sind. Einen ersten Hinweis auf polare Selektivität liefern – neben der Übersichts-Selektivitätskarte – die Balkendiagramme sterische und aromatische Selektivität (Zugänglichkeit Silanolgruppen, π-π-Wechselwirkungen). Den Hinweis auf stärkere polare Wechselwirkungen bzw. Wasserstoffbrücken-Bindungen – z. B. für Säuren – liefert der alpha-Wert Phe/EB (Phenol/Ethylbenzol). Der alpha-Wert schließlich Benz/Phe (Benzylamin/Phenol) wäre als Maß für das Verhältnis Ionenaustausch-/Wasserstoffbrücken-Bindungen anzusehen: So zeugt eine irreversible Adsorption der starken Base Benzylamin (alpha-Wert Benz/Phe nominell größer 20) von der Neigung der entsprechenden stationären Phase zu starken Kationenaustausch-Wechselwirkungen und damit weist sie einen stark polaren Charakter auf. Anhand der Selektivitätskarten und der Balkendiagramme können Alternativsäulen oder umgekehrt ziemlich unterschiedliche Säulen für orthogonale Tests (z. B. zur Überprüfung der Peakhomogenität) oder zum Bestücken eines Säulenwechslers ausgesucht werden. 

In der Säulentabelle findest du die physikalisch-chemischen Daten der Säulen, die Trenn- oder Selektivitätsfaktoren alpha, usw. Du kannst natürlich auch nur bestimmte Spalten anzeigen lassen. So findest du beispielsweise bei der Detail-Ansicht in der ersten Spalte die Namen der Säulen, in der dritten deren Kurzcharakteristik. 

Die Chemie dahinter

Als Zuordnungskriterium wird die Selektivität verwendet, angegeben als alpha-Wert aussagekräftiger Analytpaare, ermittelt unter isokratischen Bedingungen

Begründung für die Verwendung von alpha-Werten als Kriterium für den Vergleich von Säulen:

Erstens, stellen alpha-Werte ein Maß für die Selektivität dar und jene beeinflusst die Auflösung (Abstand von Peaks an der Peakbasis) bei weitem am stärksten. Bei gleichbleibenden Bedingungen (Eluent, Temperatur) tritt der Einfluss der stationären Phase auf die Trennung klar hervor. Ferner erlauben alpha-Werte den Vergleich von stationären Phasen unabhängig von aktuellen Säulendimensionen und von dem Fluss. Zweitens: Wir denken, dass aus Anwendersicht in etwa solche Fragen interessieren, wie: „Welche Säule trennt ähnlich wie XYZ? Oder: „welche Säule ist ganz anders als…?“ „welche Säulen zeigen eine gute Selektivität für die Trennung von…?“ Es geht letzten Endes um die Trennung. Es dürfte aus praktischer Sicht nicht so essentiell sein zu erfahren, ob die Wechselwirkungen an diesen zwei Säulen ähnlich sind, ob also die Komponenten mit dem gleichen Retentionsfaktor, k, eluieren. Auch der Asymmetriefaktor erscheint uns als Kriterium weniger dienlich: Wenn die Packungsqualität der Säule nachlässt oder an der Apparatur ein Totvolumen vorliegt, kann Bandenverbreiterung/Tailing fälschlicherweise etwa Silanolgruppen zugeordnet werden. Bemerkung: Alpha = 1 bedeutet Koelution. Je größer die Differenz zwischen dem gemessenen alpha-Wert und der „1“ ist, umso selektiver, also umso „trennfähiger“ ist die entsprechende Phase für diese Art von Analyten. Die Zahl kann natürlich auch kleiner 1 sein (Elutionsumkehr) – die Trennfähigkeit der Phase zur Trennung dieser Analyten ist natürlich auch in einem solchen Fall gegeben.

In der Literatur wird häufig als Kriterium die „Hydrophobie“ (Retentionsfaktor k einer apolaren Komponente), manchmal auch der Asymmetriefaktor, meistens einer Base, verwendet. Wenn du also im vorliegenden Tool andere Zuordnungen bzgl. Ähnlichkeit/Unterschiedlichkeit von Säulen erhältst als in der Literatur oder auf Säulenhersteller-Seiten angegeben, könnte die Ursache der weiter oben dargelegte Grund sein. Evtl. auch, dass hier ausschließlich pufferfrei und isokratisch gearbeitet wird: Puffer führen zwar zu einer besseren Peakform – genauso wie ein Gradient – egalisieren jedoch Unterschiede zwischen stationären Phasen, was gerade hier für das anvisierte Ziel kontraproduktiv wäre. Und schließlich: Die Tests führen wir mit Methanol/Wasser-Gemischen durch, da Acetonitril wegen seiner geringen Viskosität zu einer „schönen“ Peakform führt. Methanol/Wasser-Gemische zeigen dagegen „ehrlicher“ die Unterschiede zwischen stationären Phasen.

Für folgende fünf Fälle schaust du dir am besten die Balkendiagramme an:

  • Große, unsubstituierte Aromaten: Aromatische Selektivität
  • Polare, nicht geladene Moleküle: Hydrophobe Selektivität
  • Apolare/polare Moleküle: Hydrophobe Selektivität
  • Schwache Säuren/Basen: Hydrophobe Selektivität
  • Starke Säuren/Basen, sterische Selektivität: Polare Selektivität I
  • Sehr ähnliche Moleküle: Sterische Selektivität
  • Gute Selektivität für unterschiedliche Substanzen: Allgemeine Selektivität

Oder aber, du weißt es einfach nicht; dann gehe zu „Tipps für eine unbekannte Probe

Die Infos zu den weiter unten erklärten Selektivitäten findest du in der Übersichts-Selektivitätskarte und auch zu den einzelnen Selektivitäts-Balkendiagrammen.

Hydrophobe Selektivität (α EB/Fl): Trennfähigkeit der Phasen für Analyte mit unterschiedlichem hydrophoben Charakter; grobe Einteilung: α > ca. 1,4: Gute hydrophobe Selektivität, α > ca. 1,6: Sehr gute hydrophobe Selektivität, α < 1 (Elutionsumkehr): Recht polare Phasen. Sehr großer bzw. sehr kleiner (α < 1) alpha-Wert α EB/Fl zeugt von der Fähigkeit der entsprechenden Phase zur Trennung unterschiedlicher hydrophoben Analyten unabhängig von der Elutionsreihenfolge, (Übersichts-Selektivitätskarte, Balkendiagramm α EB/Fl)

Sterische Selektivität (α Tri/o-Ter): Trennfähigkeit der Phasen für Moleküle mit ähnlichem chemischen Charakter und ähnlicher Molekülgröße aber mit Unterschieden in der räumlichen Anordnung (z. B. planar/nicht planar). Gute sterische Selektivität zeigen Phasen, die polare Wechselwirkungen eingehen können, das sind Phasen mit kleinen α-Werten EB/Fl. Darüber hinaus auch Phasen, die eine vernetzte/Polymerschicht an der Oberfläche aufweisen, z. B. Nucleodur ISIS, Nucleosil AB, SMT OD C18, Ultrasep ES C18 E (Übersichts-Selektivitätskarte, Balkendiagramm α Tri/o-Ter)

Aromatische Selektivität (α Per/Chr):Trennfähigkeit der Phasen für große unsubstituierte Aromaten. Trennung über π-π-Wechselwirkungen; hier zeichnen sich bzgl. guter aromatischer Selektivität polare Phasen aus (Balkendiagramm α Per/Chr); es ergibt sich eine recht gute Korrelation mit α Tri/o-Ter, für eine differenzierte Betrachtung siehe jedoch auch α Tri/o-Ter vs. α Per/Chr 

Polare Selektivität 1 (α Phe/EB): Trennfähigkeit der Phasen für Analyte mit einer Differenz einer CH3 – bzw. -CH2 -CH3–  vs. OH-Gruppe (siehe Balkendiagramme α Phe/EB  und α Phe/T). Analog der hydrophoben Selektivität, zeugt ein großer bzw. ein kleiner (α < 1) alpha-Wert α Phe/EB von der Fähigkeit der entsprechenden Phase zur Trennung von Analyten mit einer/keiner sauren Gruppe – unabhängig von der Elutionsreihenfolge

Polare Selektivität 2 (α Benz/Phe): Große α-Werte sind der Hinweis auf stark polare Phasen, die Ionenaustausch-Wechselwirkungen eingehen können, siehe α Phe/EB vs. α Benz/Phe

Der alpha-Wert Benz/Phe (Benzylamin/Phenol) ist als Maß für das Verhältnis Ionenaustausch-/Wasserstoffbrücken-Bindungen anzusehen. Ferner zeugt ein starkes Tailing und eine lange Retentionszeit oder gar eine irreversible Adsorption der starken Base Benzylamin (alpha-Wert Benz/Phe nominell größer 20) von der Neigung der entsprechenden stationären Phase zu starken Kationenaustausch-Wechselwirkungen, somit weist sie einen starken polaren Charakter auf. Es ergibt sich bzgl. Peakform von Benzylamin von nicht-bewertbarem Peak bis zu recht symmetrischem Peak, siehe Beispiel. An diesen 12 Säulen (beispielhaft!) ist die Peakform von Benzylamin sehr gut: Es fehlen an der Oberfläche (zugängliche) acide Silanolgruppen und somit finden kaum Kationen-Austauschwechselwirkungen statt, das Ergebnis lautet: Symmetrische Peaks auch bei starken Basen. Bemerkung: Der Benzylamin-Test ist ein sehr strenger Test.

Rund um Colona

Nein; der Benzylamin-Test ist ein sehr strenger Test: Im Falle von stark polaren Phasen wie PFP- oder älteren, acide Silanolgruppen-haltigen Materialien wird eine irreversible Adsorption festgestellt oder aber Benzylamin eluiert als nicht-auswertbarer Peak. Aus diesem Grunde wird bei 35 Säulen bei der Erstellung der Netzdiagramme für die alpha-Werte Benzylamin/Phenol ein theoretischer alpha-Wert Benz/Phe von 20 zugrunde gelegt. Bei den fehlenden Daten zu physikalisch-chemischen Eigenschaften von Materialien konnten wir leider weder aus der Literatur noch vom Hersteller die entsprechende Info erhalten.

  • Die Retentionszeiten und die daraus errechneten alpha-Werte sollten zuverlässig sein: Es sind selbst gemessene Werte und sie wurden durch Wiederholmessungen – auch über einen längeren Zeitraum – bestätigt
  • Die Aussagen beziehen sich streng genommen auf die untersuchten Substanzen und die verwendeten chromatographischen Bedingungen. Durch die große Anzahl an unterschiedlichen Analyten und die Bandbreite an gewählten chromatographischen Parametern dürften die Aussagen jedoch eine gewisse allgemeine Gültigkeit haben. Dennoch können sich bei anderen Bedingungen (pH-Wert, Gradient etc.) natürlich andere Ähnlichkeiten bei den Säulen ergeben. Ferner: Bei mehreren Säulen wurden zwar unterschiedliche Chargen getestet, dennoch stammen die Zahlen nicht einem statistischen Datenmaterial. Grundsätzlich: Um die Ähnlichkeit von Säulen beurteilen zu können, solltest du mehrere Zahlenwerte berücksichtigen. Dazu eigen sich beispielsweise die Netzdiagramme sowie xy-Punktdiagramme. So kann eine Zahlendifferenz einzelner alpha-Werte – speziell bei polaren Analyten – eine unverhältnismäßig große Unterschiedlichkeit suggerieren. Eine Differenz etwa zwischen alpha = 1,09 und alpha = 1,16 ist eine wirklich kleine, signifikant ist grundsätzlich eine Differenz > ca. 15-20 %
  • Bei den Zahlenwerten zu den physikalisch-chemischen Daten der Säulen (Kohlenstoffgehalt, Porendurchmesser usw.) handelt es sich um Literatur- bzw. Herstellerangaben. Bei den fehlenden Werten konnten weder aus der Literatur noch seitens der Hersteller Informationen erhalten werden. Solltest du eine entsprechende Info haben, sind wir natürlich alle froh. Melde uns bitte einfach den entsprechenden Wert. Danke.

Folgende Menschen haben zur Realisierung des Projektes „Colona“ beigetragen: Debora Grossmann, Antoni Kromidas, Hans-Joachim Kuss, Daniel Stauffer, Stefan Lamotte, Stavros Kromidas

Software-updates/-grades erfolgen unregelmäßig nach Bedarf. Bezüglich der Erweiterung um neuen Säulen ist das Procedere wie folgt: Das Team beobachtet den Markt und avisiert interessante Produkte; es werden Erfahrungen gesammelt, die interessantesten Säulen gelangen zur Testung .  Alle zwei Jahre findet eine Erweiterung statt, die Anzahl der neuen Säulen kann naturgemäß schwanken. 

Nein, nicht direkt; die meisten Hersteller haben uns aus nachvollziehbaren Gründen ihre Säulen zur Verfügung gestellt. Einige Säulen haben wir gekauft. Die Datenbank als solche ist streng neutral.

Top 10 FAQ